مطالب زیر پیرامون مبحث ازمایشگاه عملی ویروس( pcrو پرایمر )است .
پرایمر :
پرایمر در زیست شناسی مولکولی به رشتهای از نوکلئیک اسید گفته میشود که برای آغاز همانندسازی بهکار میرود. پرایمر از این رو در همانندسازی نیاز است که آنزیم همانندساز، دیانای پلمیراز، تنها توانایی افزوند نوکلئوتید به یک رشته را دارد. پلیمراز همانندسازی را از انتهای ۳٬ پرایمر آغاز میکند و از روی رشتهی مخالف الگوبرداری میکند. در طبیعت و در بیشتر موردها، پرایمری که برای همانندسازی به کار میرود، یک رشتهی کوتاه آرانای است، که خود میتواند نوپدید سنتز شود. پرایمرها در بسیاری از آزمایشهای مولکولی و بیوشیمیایی که از دیانای پلیمراز بهره میبرند، همانند واکنش زنجیره پلیمراز یا توالییابی دیانای، به کار میروند. این گونه پرایمرها بیشتر اولیگونوکلئوتیدهای کوتاهی هستند که اغلب به صورت شیمیایی تولید شدهاند و با درازای ۱۸-۲۵ نوکلئوتید هستند.
طراحی پرایمر برای واکنش زنجیرهای پلیمراز
ابزار برخط و رایگان NCBI به نام Primer Blast، دو ابزار BLAST و طراحی پرایمر را یکجا گرد آورده است. از BLAST میتوان برای بررسی یگانه بودن پرایمر در توالی DNA بهره جست.
PCR به زبان ساده
پيشرفت هاي دو دهه اخير در زمينه بيولوژي مولكولي موجب ارتقاء كارآيي و تكامل هر چه بيشتر
آزمايش هاي وابسته به DNA در علوم باليني گرديده است. استفاده از ماركرهاي غير راديواكتيو و
اوليگونوكلئوتيدهاي مكمل با ژن ها و يا ترادف هاي ويژه بازهاي آلي در DNA از جمله پيشرفت هاي
مؤثر در بهبود و بكارگيري روز افزون تست هاي وابسته به DNA در طيف تشخيص باليني محسوب
مي شود. يكي از مهمترين پيشرفت ها در زمينه بيولوژي مولكولي كه در عين حال كاربرد
تشخيصي نيز دارد Polymerase Chain Reaction) PCR )مي باشد كه علاوه بر سريع نمودن
آزمايش هاي وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزايش حساسيت اينگونه آزمايش ها گرديده
است.
با توجه به پيشرفت روزافزون علوم پزشكي در جهان امروز و استفاده وسيع از PCR بعنوان يك روش
حساس، سريع و دقيق تشخيصي در آزمايشگاههاي باليني، در اين گفتار سعي شده است تا
PCR و مكانيسم آن به زباني ساده و بطور اجمالي بيان شود تا پزشكان و متخصصيني كه در
عرصه هاي آزمايشگاهي از نزديك با اين تكنيك بسيار مفيد كار نكرده اند با چگونگي عملكرد آن
آشنايي پيدا كنند. ذكر اين نكته ضروري است كه راه اندازي اين روش و يا روش هاي مشابه در
زمينه بيولوژي مولكولي و بهره وري از آنها در مراكز آزمايشگاهي و تحقيقاتي، منجر به حصول نتايج
چشمگير و سودمند در زمينه تشخيص آزمايشگاهي و همچنين مطالعات اپيدميولوژيك خواهد شد.
تعريف PCR
به طور كلي PCR به روش ازدياد مقادير جزيي DNA يا RNA (ازدياد RNA با روشRT-PCR امكان پذير
است) تا حد مشاهده آنها توسط روش هاي ساده و رايج آزمايشگاهي اطلاق مي شود. قابليت
PCR در ازدياد اسيدهاي نوكلئيك موجود در نمونه مورد آزمايش موجب شناسايي سريع و
اختصاصي نوع سلول يا ميكروارگانيسم مورد نظر در نمونه مذكور مي گردد كه اين ويژگي علاوه بر
بكارگيري PCR در تشخيص آزمايشگاهي بيماريها و شناسايي انواع سلولها، آن را به عنوان ابزاري
مطمئن و حساس در زمينه پژوهش هاي علمي مطرح مي سازد.
از زمان معرفي PCR در سال 1983، بكارگيري آن در تحقيقات بيولوژيكي پايه و كاربردي موجب
ايجاد تغييرات اساسي گرديده است. PCR يكي از تكنولوژي هاي مدرن آزمايشگاهي است كه در
تشخيص بيماريهاي عفوني، پزشكي قانوني و ناهنجاريهاي ژنتيكي مورد استفاده و توجه قرار
گرفته است. در خصوص كارآيي اين روش در تشخيص به عنوان مثال مي توان تقليل مدت زمان
تشخيص آزمايشگاهي اختصاصي باسيل سل در نمونه هاي كلينيكي را از 7-6 هفته به 7-6
ساعت حتي با وجود تعداد اندك باسيل در نمونه آزمايشگاهي ذكر كرد. از نكات جالب توجه ديگر
اينكه با استفاده از تكنيك حساس DNA ، PCR ميكروارگانيسم هايي نظير باسيل جذام و باسيل
سل از نمونه هاي باستاني با قدمت بيش از 1000 سال شناسايي و جدا گرديده است كه نتايج
حاصله گامي مهم در راه شناخت و مطالعه بيش از پيش تاريخچه علم پزشكي بوده ضمن آنكه اين
موفقيت توانسته است راهگشاي ايجاد شاخه هاي ديگري از علوم نظير پالئوباكتريولوژي باشد.
مكانيسم PCR
همانطور كه مي دانيم DNA، يك مولكول مارپيچي دو رشته اي پلي نوكلئوتيدي است كه اين دو
رشته در جهت مقابل هم قرار گرفته اند و بطور ويژه اي بوسيله پيوندهاي هيدروژني ميان بازهاي
آلي مكمل يكديگر متصل هستند (سيتوزين بوسيله سه پيوند هيدروژني به گوانين و آدنين بوسيله
دو پيوند هيدروژني به تيمين اتصال پيدا مي كند). DNA دورشته اي مي تواند به وسيله حرارت از
هم جدا شده و دو مولكول DNA تك رشته اي ايجاد كند كه اين مرحله بنام مرحله تغيير ماهيت
(تقليب) شناخته مي شود. مولكولهاي DNA تك رشته اي از طريق واكنش هاي متقابل ويژه بين
بازهاي مكمل به همديگر متصل شده كه حاصل آن ايجاد و آغاز مرحله اي بنام مرحله اتصال
annealing و يا hybridization مي باشد. دو مرحله فوق الذكر هم براي Probe technology و هم
برای PCR بكار مي رود. مرحله بعدي PCR که اين روش را از ساير تكنيك هاي مولكولي متمايز مي
سازد، مرحله توسعه (extension) مي باشد كه طي آن يك قطعه DNA تك رشته اي بوسيله
DNA پليمراز توسعه پيدا مي كند. در اين مرحله يك قطعه DNA تك رشته اي كوتاه (primer) به يك
مولكول DNA تك رشته اي طويل تر متصل شده و DNA پليمراز (Taq پليمراز) قادر مي شود به
انتهاي ´3 مولكول پرايمر متصل گرديده و با استفاده از داُكسي نوكلئوتيد تري فسفات ها آنرا
امتداد داده و قطعه اي سنتز نمايد كه آن قطعه مكمل DNA تك رشته اي الگو باشد و بدين ترتيب
DNA دو رشته اي جديد ساخته مي شود.
بطور کلی هر چرخه PCR شامل سه مرحله مي باشد:
1- مرحله تغییر ماهیت (Denaturation Step)
در اين مرحله مولكولهاي دو رشته اي DNA بوسيله حرارت بالا (حدود 94 درجه سانتيگراد) از
همديگر جدا گرديده و به مولكولهاي تك رشته اي تبديل مي شوند.
پرایمرها (اوليگونوكلئوتيدها) به وسيله تكنيك هاي شيميايي به صورت سريع و ارزان ساخته مي
شوند. اوليگونوكلئوتيدها وقتي كه به DNA دناتوره شده افزوده مي شوند، به عنوان پرايمر براي
DNA پليمراز عمل نموده و اجازه مي دهند تا DNA جديد در داخل آزمايشگاه سنتز شود. در PCR
دو نوع پرايمر مورد استفاده قرار مي گيرد كه هر كدام از آنها به محل هاي ويژه در دو رشته مكمل
مولكول DNA هدف پيوند مي شوند. پرايمرهاي مذكور به صورتي ساخته شده اند كه زمانيكه
DNA پليمراز، يك پرايمر را توسعه مي دهد، يك مولكول DNA بوجود مي آورد كه آن DNA داراي يك
محل اتصال جديد براي پرايمر ديگر مي شود. اين رشته DNA جديد توليد شده نيز همينطور قادر
خواهد بود به عنوان الگو (template) براي سنتز DNA از پرايمر ديگر در جريان چرخه هاي بعدي
PCR عمل نمايد.
2- مرحله اتصال (Annealing or Hybridization Step)
در اين مرحله كاهش دماي واكنش صورت مي گيرد تا اينكه پرايمرها بتوانند به مولكولهاي DNA تك
رشته اي پيوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده براي اين مرحله مي تواند از 30 درجه
سانتيگراد تا 72 درجه سانتيگراد متغير باشد.
3- مرحله توسعه (Extension Step)
در اين مرحله كه آخرين مرحله يك چرخه PCR مي باشد، آنزيم Taq پليمراز (كه DNA پليمرازي
است مقاوم به حرارت و از يك باكتري ترموفيل به نام ترموس آكواتيكوس
Thermus aquaticus استخراج مي شود) با استفاده از داُكسي نوكلئوتيد تري فسفاتها، پرايمر را
در روي DNA تك رشته اي امتداد مي دهد تا DNA دو رشته اي جديد بسازد. درجه حرارت لازم
براي اين مرحله72 درجه سانتيگراد ميباشد كه اين درجه حرارت براي آنزيم هاي مقاوم به
حرارتي كه به طور عادي مورد استفاده قرار مي گيرند مناسب مي باشد.
هر چرخه PCR نهايتاً با دو برابر شدن تعداد ترادف هاي DNA هدف همراه است كه تكرار چرخه
بدفعات زياد (20 تا 40 بار) منجر به افزايش توالي در تعداد ترادف هاي DNA هدف و در نتيجه ازدياد
DNA هدف به ميزان يك ميليون برابر يا بيشتر خواهد شد.
از زمان اختراع PCR، دو پيشرفت تكنيكي عمده به طور قابل توجهي روند PCR را اصلاح كرده
است. اولين پيشرفت، بكارگيري و ترويج پليمرازهاي مقاوم به حرارت همانند Taq پليمراز بوده
است كه اين آنزيم توانايي مقاومت در برابر مرحله تغيير ماهيت يا تقليب يعني حدود 94 درجه
سانتيگراد را دارد. اين بدان معني است كه در حال حاضر مي توان بدون افزودن آنزيم پليمراز تازه
بعد از هر مرحله تغيير ماهيت (تقليب) به لوله هاي PCR، آزمايش PCR را انجام داد. دومين
پيشرفت عمده، توسعه تجارتي بلوك هاي حرارتي قابل برنامه ريزي مي باشد كه اين بلوك ها به
ترمال سايكلرها (Thermal cycler) معروف هستند. استفاده از ترمال سايكلر در انجام PCR باعث
حذف مرحله خسته كننده و وقت گير انتقال لولههاي PCR از يك بن ماري به بن ماري ديگر مي
شود ، زيرا اين دستگاه كه قبلاً بوسيله خود آزمايش كننده تنظيم و برنامه ريزي شده است به طور
اتوماتيك حرارتهاي لازم را براي مراحل سه گانه PCR توليد مي نمايد ضمن اينكه تعداد چرخه هاي
مورد نياز نيز براي انجام PCR و ازدياد DNA بطور اتوماتيك در اين دستگاه قابل برنامه ریزی می
باشد.
با دو پيشرفت فوق الذكر اكنون ما مي توانيم تمامي اجزاء PCR را كه عبارتند از بافر PCR، دو نوع
پرايمر، چهار نوع داُكسي نوكلئوتيد تري فسفات dCTP , dTTP , dATP و dGTP، آنزيم Taq پليمراز
و DNA الگو (كه با روش هاي مختلف قابل استخراج مي باشد) با همديگر در لوله هاي پلي پروپيلن
مخلوط كرده و پس از افزودن يك قطره روغن معدني بر سطح مخلوط ها، بدون حضور شخص
آزمايش كننده لوله هاي PCR را به مدت چند ساعت در ترمال سايكلر برنامه ريزي شده از قبل قرار
داد تا PCR انجام شود. واكنش هاي تكميل شده بر روي ژل آگارز برده شده و سپس محصولات
PCR يا به عبارت ديگر DNAهاي ازدياد يافته در روي ترانس ايلوميناتور قابل رويت مي شوند.
در سالهاي اخير در زمينه اپيدميولوژي و تشخيص ميكروارگانيسم ها تغييراتي در PCR داده شده
است. از جمله اين تغييرات، تكثير 16S RNA بجاي DNA باكتري است. 16S RNA يكي از انواع
RNA ريبوزومي است. اين روش نسبت به تكثير DNA ميكروارگانيسم داراي برتري هايي است كه
عبارتند از:
1- واكنش ايزوترمال است يعني در يك دما انجام ميگيرد. بدين ترتيب نيازي به استفاده از دستگاه
ترمال سايكلر نيست.
2- از آنجائيكه هر باكتري داراي بيش از 2000 كپي RNA ريبوزومي است، حساسيت PCR افزايش
مي يابد. بنابراين به جاي يك DNA در ميكروارگانيسم، هزاران هدف در يك باكتري وجود دارد.
3- محصولات PCR پايدار نيستند. در نتيجه خطر آلودگي به مراتب پائين است.
در تحقيقات اپيدميولوژيك، شناسايي دقيق سوش عامل بيماري با روش هاي مختلفي از جمله
روش ريبوتايپينگ (Ribotyping) (كه در آن RNA ريبوزوم تكثير مي يابد) يا با تعيين الگوي انگشت
نگاري DNA انجام مي گيرد.